Poniendo en contexto nuestro trabajo

 Hola a todos,

en breve deberemos exponer lo que hemos hecho en el próximo congreso del 8 de Mayo.

Como aperitivo os recomiendo le echéis un vistazo a esta noticia  "Un virus me salvó la vida" de hace ya algún tiempo pero que no por ello deja de ser actual:

Portada de  la Noticia en el SEMANAL el Viernes, 10 de Marzo 2023.

Apoyada por la empresa farmacéutica Roche, describe la estrategia basada en una terapia con un cóctel de fagos llevada a cabo por el hospital Vall de Hebron para curar a una paciente con un problema muy serio de una infección bacteriana que no respondía a los antibióticos.

Como os podéis imaginar, investigaciones como la que habéis llevado a cabo en nuestro proyecto, son importantes para que el desarrollo de este tipo de terapias sean seguras y que no den lugar a nuevas resistencias bacterianas.

Entender lo que hemos observado

Ayer Martes 8 de Abril tuvimos una reunión online super importante y clarificadora. A la reunión estuvimos casi todos (Faltaron Ivan y Jose Luis). Tras revisar los últimos resultados (ver el blog anterior) nos quedó claro todo lo que habíamos hecho.

Que se puede resumir en tres claras conclusiones que formarán parte de nuestro trabajo final:

Y como podemos intuir estas tres conclusiones definen nuestro trabajo a exponer  y defender.

En una exposición similar a la de otros años (echadle un vistazo a blogs previos), tendremos que explicar todo lo que hemos hecho. La fecha clave va a ser el próximo Jueves 8 de Mayo

Que es cuando tendremos que exponer a nuestros compañeros de otros proyectos, padres, familiares, etc. Y por supuesto otros investigadores en el congreso CAOS V que tendrá lugar en la EEZ.

En esta reunión online tb pensamos y discutimos el posible título de nuestro trabajo. Consensuamos algo así:

“Single mutations change the Phage resistance profile in the soil bacteria Sinorhizobium meliloti”

Nuestro investigador nos ayudará a prepararnos sobre esta exposición que consistirá en 7-8 min y en Inglés!!! que deberemos practicar cada uno en particular y todos en conjunto en próximas reuniones on line y quizás presenciales…

En la exposición tendremos: Introducción, metodología, resultados, y conclusiones. Todos estos apartados los dividiremos para que el público entienda lo que hemos realizado.

Una vez tengamos este “guión” nos servirá de base para desarrollar a su vez un poster así como nuestro artículo que tendrá que estar finalizado a primeros de Junio.

Animo grupo que estamos ya cerca de culminar un año inolvidable.

Consensuamos la próxima reunión para el Martes 22 de Abril a las 17:00 h.

Allí Sí, deberíamos de estar todos!!!

Hip hip Hurra!!!!

Nuestros últimos resultados

Ya hace algún tiempo, el 21 de Marzo tomamos las fotos de los plaqueos de los fagos en los distintos césped bacterianos…

Fotos que serán la base de nuestros últimos resultados que responden a la pregunta planteada:

¿¿Cual es el efecto de las dos mutaciones que íbamos a estudiar en lo que a resistencia al fago se refiere???

Las dos mutaciones que estamos estudiando afectan a dos dominios importantes descritos en el gen UG5:

En estos resultados observamos cómo ambas mutaciones tienen un efecto dramático en lo que a infección por el fago se refiere:

 Nuestro investigador ha montado varias figuras que por si mismas explican que algo importante ha pasado a la bacteria.

Y es que como podemos observar en la figura, cualquiera de las dos mutaciones eliminan por completo el fenotipo de resistencia que tiene la bacteria.

Este mismo resultado lo podemos graficar mediante extrapolación del título de fago en base al plaqueo observado.

 

Y con este utimo resultado respondemos a la pregunta planteada allá por el mes de Noviembre.

Hip, Hip Hurra….

Ya solo nos queda dar forma definitiva a nuestro trabajo.

De momento entender lo que hemos hecho y proponer un título.

EXPERIMENTOS CLAVE

 Martes  18 Marzo 2025

Esta mañana hemos continuado nuestros experimentos en esta ocasión en nuestro Laboratorio de Biología del Ayala. Y creo que hemos entendido hacia donde va nuestro experimento… , que consiste en 4 tipos de bacteria (1,2,5,7):

Que una vez crecidas durante dos días a 28ºC

Tubos con TY y 200 ug/ml de Kanamycin de las bacterias 1, 3, 5, y 7

Los cultivos con S meliloti se han extendido en placas (600 ul de un cultivo saturado por cada placa) para poder visualizar cómo se comportará el fago 3.2. Este fago, es sensible al sistema de resistencia UG5. Sería bueno que le echarais un vistazo a los blog previos del Ayala (https://dnafagos2.blogspot.com/ y https://dnafagos.blogspot.com/)

 Tras realizar las diluciones seriadas con un stock de fago con alto título. (debemos tener apuntadas en nuestras notas como las hemos hecho). Finalmente nos preguntamos cual será el comportamiento del fago frente a los 4 tipos distintos de bacteria:

 

Las placas ya están incubándose a 28ºC en nuestra estufa favorita. En un par de días tendremos los resultados.

Que nervios!!!!!!

Hoy si nos hemos merecido un descanso al final del día. y encima de todo, hemos estado haciendo los experimentos con cámaras de la televisión de Canal Sur. 

Hip, Hip, Hurra!!!!!

LOS RESULTADOS DE NUESTRO PRIMER PLAQUEO DE FAGOS

Nuestros primeros resultados

Tras los experimentos realizados en la EEZ, nos queda interpretar los resultados obtenidos de las distintas fotos que realizamos a las placas, esto es: 

1a Pregunta:

"¿Son nuestras colonias aisladas sólo S. meliloti o en algún caso son E coli???

Como muestran nuestros crecimientos en placa, los transconjugantes que tenemos se corresponden a tranformantes de S. meliloti, la bacteria GR4 con los distintos constructos y sin la presencia de E. coli. 

Podemos observar que solo hay E coli en nuestros puntos control (las x de las placas de endo agar (rosa).

Ya tenemos preparados los hospedadores para probar el papel de las distintas actividades presentes en nuestro sistema de resistencia UG5

2a Pregunta:

"¿Cual es la cantidad de fago presente en los tubos A, B y C???

Para ello debemos de analizar las diluciones seriadas y los plaqueos que hicimos. Os recuerdo, que repaseis vuestras notas... 

Nuestro investigador ha realizado la siguiente composición:

En el se plaquearon triplicados de cada una de las diluciones seriadas, lo que nos permite "contar" calvas de lisis e inferir la cantidad de fago presente en cada uno de los tubos (A, B y C)...

De manera paralela, se realizaron los plaqueos y se incubaron en la EEZ (los hizo Esperanza):

Como podeis observar, los resultados son equivalentes. Este hecho hace que dispongamos de 6 valores distintos a la hora de determinar la cantidad de fago presente.

Venga!!! que espero vuestros comentarios sobre el título de fago en cada tubo!!!. Cual de los tres tiene el título mas alto, cual el que menos?? . Para nota, si ademas podemos estimar el margen de error de nuestro conteo!!!

Ya estamos en disposición de realizar nuestros experimentos!!!!

Cual será el título de nuestro fago en los 4 tipos de bacteria que hemos preparado????

Animo Equipo que ya nos enfrentamos a las preguntas del proyecto!!!!

Nuestra Primera visita a la EEZ

 Jueves 23 Enero

Ayer fue una buena jornada. Visitasteis las instalaciones de un centro de investigación. La EEZ-CSIC, en concreto los laboratorios del departamento de Microbiología. Vamos donde tanto Paco como  Esperanza trabajan en investigación de reverso transcriptasas.

Además estuvimos acompañados por un equipo de Canal Sur, que nos han elegido como proyecto ejemplo de CAOS  de este año.

La jornada fue intensa, ya que se trataba de por un lado, confirmar que los experimentos llevado a cabo el pasado diciembre (ver entradas previas) se correspondían con lo que nuestro investigador decía.

Para ello, la sesión se dividió en tres partes.

La primera

se trataba de distinguir de visu (a la Lupa) el tipo de colonias que presenta la bacteria E coli frente a S meliloti.

Esta es la lupa de la que disponemos para tomar imagenes de las colonias. Lupa con la que se pudieron observar las diferencias en la forma de colonia, y es que:

    

Como apuntó Javier, de las diferencias más destacadas aparte del tamaño es el formato de colonia, mucho más irregular en el caso de E coli. Este hecho será importante tenerlo en cuenta a la hora de estar seguros de que trabajamos con S meliloti. Por cierto, la única bacteria que se terminará infectando con nuestro fago.

La segunda parte

ibamos a demostrar que tenemos verdaderos transconjugantes. Para ello, nuestro investigador propone que hagamos replicas de colonias individuales en un medio denominado ENDO-Agar, medio exclusivo para el crecimiento de E coli.

El resultado que esperamos obtener es:

Colonias que crezcan en medio TY km (con el antibiótico y que no crezcan en endo agar. Ello significará que lo que tenemos son colonias de S meliloti aisladas y con nuestros vectores que consistían en 4 tipos de construcciones:

 

Y por último la tercera parte consistió en la realización de diluciones seriadas de fago sobre césped de bacteria GR4 con el vector vacía (la tipo 1).

 

Pronto sabremos si las diluciones realizadas han sido adecuadas para responder a la pregunta lanzada por nuestro investigador: Cuanto fago hay en el tubo A, y en el tubo B y en el tubo C ???. Necesitamos tb conocer los márgenes de error derivados de nuestro conteo de calvas de fago.

 Este fin de semana se encuentran las placas en la estufa de nuestro centro El Ayala.

El lunes deberemos tomar fotos de los distintos resultados: 

 Son nuestras colonias aisladas sólo S meliloti o en algún caso son E coli???

Cual es la cantidad de fago presente en los tubos A, B y C???

Animo, que ya empezamos a estar en disposición de enfrentarnos a las preguntas del proyecto.

Aupa Equipo!!!!!!

Nuestra Primera Sesión on line (2ª Reunión)

 Miercoles 18 diciembre

El pasado Martes 17 de diciembre nos vimos las caras a través de pantallas del ordenador para discutir los resultados de nuestros extendidos y plantear los próximos pasos en nuestra investigación.

Foto de pantallazos de reunión…

Las conjugaciones salieron de libro, os recuerdo, para cada mezcla de bacterias a conjugar se puso a su vez un control negativo en el que la bacteria que hacia de puente (prK2013) entre la donadora del DNA y la aceptora no se añadía.

Así, en nuestros extendidos solo afloraron colonias aisladas (conjugantes positivos) en aquellas mezclas donde estaban las tres bacterias participantes (ver la siguiente imagen a modo de ejemplo

 

Sólo en la 5 aparecen colonias asiladas y no en las dos réplicas de la placa 6 donde no se añadió la bacteria helper (pRK2013). Igual sucedió con los demás constructos, ver documento conjugaciones en recursos.

Así pues, ya tenemos el material de partida para probar el efecto de las mutaciones en el locus UG5 sobre la resistencia a fagos en S. melloti.

Pero, en qué consisten esas mutaciones.

Son cambios puntuales en la proteína que codifica el gen UG5

Uno de ellos consiste en sustituir dos aspárticos (dd) a alaninas (aa). Este cambio está descrito que genera una proteína sin actividad reverso transcriptasa. El segundo mutante tiene cambiada una cisteína (la C876) a Alanina. Cisteína muy conservada en todas las enzimas nitrilasas estudiadas y que tiene importantes consecuencias en la actividad Nitrilasa.

Paco nos enseñó mediante un programa lector del ADN cómo se habían generado esas mutaciones.

Ya estamos en condiciones de entender hacia donde nos dirigimos y qué podremos esperar de nuestros próximos experimentos!!!

 

Aupa Equipo!!!