EXPERIMENTOS CLAVE

 Martes  18 Marzo 2025

Esta mañana hemos continuado nuestros experimentos en esta ocasión en nuestro Laboratorio de Biología del Ayala. Y creo que hemos entendido hacia donde va nuestro experimento… , que consiste en 4 tipos de bacteria (1,2,5,7):

Que una vez crecidas durante dos días a 28ºC

Tubos con TY y 200 ug/ml de Kanamycin de las bacterias 1, 3, 5, y 7

Los cultivos con S meliloti se han extendido en placas (600 ul de un cultivo saturado por cada placa) para poder visualizar cómo se comportará el fago 3.2. Este fago, es sensible al sistema de resistencia UG5. Sería bueno que le echarais un vistazo a los blog previos del Ayala (https://dnafagos2.blogspot.com/ y https://dnafagos.blogspot.com/)

 Tras realizar las diluciones seriadas con un stock de fago con alto título. (debemos tener apuntadas en nuestras notas como las hemos hecho). Finalmente nos preguntamos cual será el comportamiento del fago frente a los 4 tipos distintos de bacteria:

 

Las placas ya están incubándose a 28ºC en nuestra estufa favorita. En un par de días tendremos los resultados.

Que nervios!!!!!!

Hoy si nos hemos merecido un descanso al final del día. y encima de todo, hemos estado haciendo los experimentos con cámaras de la televisión de Canal Sur. 

Hip, Hip, Hurra!!!!!

LOS RESULTADOS DE NUESTRO PRIMER PLAQUEO DE FAGOS

Nuestros primeros resultados

Tras los experimentos realizados en la EEZ, nos queda interpretar los resultados obtenidos de las distintas fotos que realizamos a las placas, esto es: 

1a Pregunta:

"¿Son nuestras colonias aisladas sólo S. meliloti o en algún caso son E coli???

Como muestran nuestros crecimientos en placa, los transconjugantes que tenemos se corresponden a tranformantes de S. meliloti, la bacteria GR4 con los distintos constructos y sin la presencia de E. coli. 

Podemos observar que solo hay E coli en nuestros puntos control (las x de las placas de endo agar (rosa).

Ya tenemos preparados los hospedadores para probar el papel de las distintas actividades presentes en nuestro sistema de resistencia UG5

2a Pregunta:

"¿Cual es la cantidad de fago presente en los tubos A, B y C???

Para ello debemos de analizar las diluciones seriadas y los plaqueos que hicimos. Os recuerdo, que repaseis vuestras notas... 

Nuestro investigador ha realizado la siguiente composición:

En el se plaquearon triplicados de cada una de las diluciones seriadas, lo que nos permite "contar" calvas de lisis e inferir la cantidad de fago presente en cada uno de los tubos (A, B y C)...

De manera paralela, se realizaron los plaqueos y se incubaron en la EEZ (los hizo Esperanza):

Como podeis observar, los resultados son equivalentes. Este hecho hace que dispongamos de 6 valores distintos a la hora de determinar la cantidad de fago presente.

Venga!!! que espero vuestros comentarios sobre el título de fago en cada tubo!!!. Cual de los tres tiene el título mas alto, cual el que menos?? . Para nota, si ademas podemos estimar el margen de error de nuestro conteo!!!

Ya estamos en disposición de realizar nuestros experimentos!!!!

Cual será el título de nuestro fago en los 4 tipos de bacteria que hemos preparado????

Animo Equipo que ya nos enfrentamos a las preguntas del proyecto!!!!

Nuestra Primera visita a la EEZ

 Jueves 23 Enero

Ayer fue una buena jornada. Visitasteis las instalaciones de un centro de investigación. La EEZ-CSIC, en concreto los laboratorios del departamento de Microbiología. Vamos donde tanto Paco como  Esperanza trabajan en investigación de reverso transcriptasas.

Además estuvimos acompañados por un equipo de Canal Sur, que nos han elegido como proyecto ejemplo de CAOS  de este año.

La jornada fue intensa, ya que se trataba de por un lado, confirmar que los experimentos llevado a cabo el pasado diciembre (ver entradas previas) se correspondían con lo que nuestro investigador decía.

Para ello, la sesión se dividió en tres partes.

La primera

se trataba de distinguir de visu (a la Lupa) el tipo de colonias que presenta la bacteria E coli frente a S meliloti.

Esta es la lupa de la que disponemos para tomar imagenes de las colonias. Lupa con la que se pudieron observar las diferencias en la forma de colonia, y es que:

    

Como apuntó Javier, de las diferencias más destacadas aparte del tamaño es el formato de colonia, mucho más irregular en el caso de E coli. Este hecho será importante tenerlo en cuenta a la hora de estar seguros de que trabajamos con S meliloti. Por cierto, la única bacteria que se terminará infectando con nuestro fago.

La segunda parte

ibamos a demostrar que tenemos verdaderos transconjugantes. Para ello, nuestro investigador propone que hagamos replicas de colonias individuales en un medio denominado ENDO-Agar, medio exclusivo para el crecimiento de E coli.

El resultado que esperamos obtener es:

Colonias que crezcan en medio TY km (con el antibiótico y que no crezcan en endo agar. Ello significará que lo que tenemos son colonias de S meliloti aisladas y con nuestros vectores que consistían en 4 tipos de construcciones:

 

Y por último la tercera parte consistió en la realización de diluciones seriadas de fago sobre césped de bacteria GR4 con el vector vacía (la tipo 1).

 

Pronto sabremos si las diluciones realizadas han sido adecuadas para responder a la pregunta lanzada por nuestro investigador: Cuanto fago hay en el tubo A, y en el tubo B y en el tubo C ???. Necesitamos tb conocer los márgenes de error derivados de nuestro conteo de calvas de fago.

 Este fin de semana se encuentran las placas en la estufa de nuestro centro El Ayala.

El lunes deberemos tomar fotos de los distintos resultados: 

 Son nuestras colonias aisladas sólo S meliloti o en algún caso son E coli???

Cual es la cantidad de fago presente en los tubos A, B y C???

Animo, que ya empezamos a estar en disposición de enfrentarnos a las preguntas del proyecto.

Aupa Equipo!!!!!!

Nuestra Primera Sesión on line (2ª Reunión)

 Miercoles 18 diciembre

El pasado Martes 17 de diciembre nos vimos las caras a través de pantallas del ordenador para discutir los resultados de nuestros extendidos y plantear los próximos pasos en nuestra investigación.

Foto de pantallazos de reunión…

Las conjugaciones salieron de libro, os recuerdo, para cada mezcla de bacterias a conjugar se puso a su vez un control negativo en el que la bacteria que hacia de puente (prK2013) entre la donadora del DNA y la aceptora no se añadía.

Así, en nuestros extendidos solo afloraron colonias aisladas (conjugantes positivos) en aquellas mezclas donde estaban las tres bacterias participantes (ver la siguiente imagen a modo de ejemplo

 

Sólo en la 5 aparecen colonias asiladas y no en las dos réplicas de la placa 6 donde no se añadió la bacteria helper (pRK2013). Igual sucedió con los demás constructos, ver documento conjugaciones en recursos.

Así pues, ya tenemos el material de partida para probar el efecto de las mutaciones en el locus UG5 sobre la resistencia a fagos en S. melloti.

Pero, en qué consisten esas mutaciones.

Son cambios puntuales en la proteína que codifica el gen UG5

Uno de ellos consiste en sustituir dos aspárticos (dd) a alaninas (aa). Este cambio está descrito que genera una proteína sin actividad reverso transcriptasa. El segundo mutante tiene cambiada una cisteína (la C876) a Alanina. Cisteína muy conservada en todas las enzimas nitrilasas estudiadas y que tiene importantes consecuencias en la actividad Nitrilasa.

Paco nos enseñó mediante un programa lector del ADN cómo se habían generado esas mutaciones.

Ya estamos en condiciones de entender hacia donde nos dirigimos y qué podremos esperar de nuestros próximos experimentos!!!

 

Aupa Equipo!!!

Nuestra Primera Sesión de Microbiología

 Miércoles 11 diciembre

Hoy por fin nos hemos puesto caras a los que vamos a participar en la III edición de genes de resistencia y fagos en la V edición de proyectos CAOS de la EEZ-CSIC.

1)       Y es que la sesión nos sirvió para varias cosas: 

1) Situarnos hacia donde nos vamos a dirigir, para ello, nuestro investigador nos hizo una presentación del proyecto (enlace en recursos: DNA-Fagos III_1) así como una introducción de lo que íbamos a hacer “microbiológicamente hablando” (Proyecto). 

2) Y es que el proyecto va a tratar de entender los mecanismos de resistencia que operan frente a Fagos, presentes en la bacteria S meliloti. En concreto, el sistema denominado UG5, consistente en un gen que codifica para una “large protein”1)      ”.

Esta mañana, hemos iniciado un proceso de conjugación bacteriana en el que una bacteria donadora Escherichia coli, va a transferir mediante puentes (Pilli) aportados por la bacteria ayudante (“Helper”; pRK2013) a Sinorhizobium meliloti plásmidos conteniendo distintas versiones de nuestro gen a estudiar que confieren la resistencia al antibiótico Kanamicina.

La práctica ha consistido en siembra en estría de mezclas de bacterias con el objeto de encontrar aislados (transformantes), libres de E. coli, y que serán nuestro punto de partida para los próximos experimentos.

También, nos hemos familiarizado con los volúmenes (ml, microlitros, …)y con las pipetas automáticas (p1000, p200, y p20), que como bien conoce Andrea, la senior del grupo van a ser la base de nuestros experimentos durante el proyecto.

 Nuestro objetivo es que en las placas impares (y solo las impares) nos aparezcan colonias aisladas tal y como se muestra en esta foto. Para ello tendremos que hacer un seguimiento desde el próximo Viernes y quizás hasta la próxima sesión,

La nueva (Segunda sesión) será on line el Martes 17 de Diciembre a las 17:00 h.

Y ya tan solo exponer en una redacción corta las primeras impresiones de este proyecto.

Ánimo, que el proyecto tiene buena pinta.

Francisco Martínez-Abarca

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Comienza un nuevo Proyecto: DNA y Resistencia a Fagos

Jueves 05/Diciembre 2024

Bienvenidos a un nuevo proyecto dedicado al estudio de fagos y sistemas de defensa frente a ellos encontrados en bacterias. Este proyecto forma parte ya de una línea de investigación con tres años de recorrido. Como ya imagináis el desarrollo de este proyecto entronca directamente con la línea de investigación que venimos desarrollando en mi grupo de investigación (Caracterización de nuevos sistemas de defensa en bacterias asociados a unos genes denominados Reverso transcriptasas; los sistemas DRT (del inglés Defense Reverse Transcriptases Systems) cuenta de Twitter: @TORO_LAB).

Este Blog, debe de servir para exponer todos nuestros avances y resultados. En el cual también tendremos recursos, enlaces, etc. Todo aquello que nos permita hacer de este proyecto una experiencia de la que nos sintamos muy orgullosos. Además debemos hacer partícipes a todo nuestro entorno: nuestros padres, nuestros compañeros de clase, profesores, amigos... Esta forma de dar a conocer nuestros resultados no es nueva; ejemplo de ello lo tenéis en los blog de proyectos anteriores que podeis vislumbrar pinchando en los enlaces respectivos.

Os recomiendo mucho que le echéis un buen vistazo.

Confío en que entre todos podamos aportar ideas y comentarios que dinamicen nuestro blog. 

Y por ahora nada más. 

Ánimo, entre todos vamos a hacer un gran proyecto.

Dr Francisco Martinez-Abarca

Estacion Experimental del Zaidin - CSIC

Department of Microbiology

C/ Profesor Albareda n 1

18008 Granada

Spain